在制備中丟失的蛋白質(zhì)是永遠(yuǎn)不可能在后面的實(shí)驗(yàn)中彌補(bǔ)回來的。蛋白質(zhì)樣品制備是許多實(shí)驗(yàn)重要的第一步。為什么要進(jìn)行樣品的制備？電泳的目的不就是分離嗎？剛剛接觸時(shí)有這樣的疑問。然并卵，由于雙向電泳一般只能分辨到 1000-3000 個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)，而樣品蛋白質(zhì)的種類可是高達(dá) 10 萬種以上，因此樣品的預(yù)分離制備是必須的。下面就來講講分離制備蛋白樣品時(shí)，你必須知道的那三件事。

1. 選對(duì)酶抑制劑，避免蛋白質(zhì)降解 

牢記最小限度的減少蛋白水解和其它形式的蛋白降解是制備樣品的第一步，這一步看似簡(jiǎn)單，但是操作中一旦方法不當(dāng)，就有可能會(huì)丟失樣品中的蛋白和導(dǎo)致蛋白被修飾。 

大家可能都知道在提取蛋白質(zhì)時(shí)要添加蛋白酶抑制劑抑制蛋白酶降解。但是有人可能會(huì)說，我明明加了 PMSF，怎么曝光出來的條帶和內(nèi)參效果幾乎一樣啊，然而 PMSF 并不是萬能的，你的目的蛋白是磷酸化的還是非磷酸化的呢？如果是磷酸化的蛋白，那么你就得換一個(gè)酶抑制劑了，羅氏的Cooktail對(duì)磷酸化的目標(biāo)蛋白效果不錯(cuò)；為了減少溫度對(duì)蛋白質(zhì)的影響，一定不能忘記低溫操作！

2. 富集蛋白有妙招 

只要你的實(shí)驗(yàn)室有一臺(tái)轉(zhuǎn)速可以超過 12000r/min 的離心機(jī)，那么就可以選用簡(jiǎn)單綠色的蛋白質(zhì)富集方法：超速離心法。一般它能滿足你 WB 所需蛋白的要求。常用的蛋白質(zhì)富集和純化方法是用丙酮、TCA、乙醇、異丙醇、氯仿/甲醇、硫酸銨、聚乙烯乙二醇(PEG)或親和層析試劑盒。然而當(dāng)你需要 HPLC-MS 的蛋白樣品時(shí)，2D-PAGE 電泳能夠?qū)⒉煌肿恿亢偷入婞c(diǎn)的蛋白質(zhì)分離，那么你的質(zhì)譜圖就再也不會(huì)只是一坨黑了！

3. 去除雜質(zhì)步驟不可少 

為什么我的質(zhì)譜圖雜帶比主帶還多，主峰去哪兒了，找不到！曝光出來的條帶像一張過敏臉，亂七八糟的！實(shí)驗(yàn)中處理用的緩沖液、鹽、清潔劑等都會(huì)影響蛋白質(zhì)分離，顯色等步驟，還會(huì)干擾質(zhì)譜分析，影響條帶灰度值的計(jì)算，所以去除緩沖液、鹽和清潔劑類雜質(zhì)顯得尤為重要。去除鹽類經(jīng)常是通過透析、超濾、膠過濾、TCA 沉淀或者有機(jī)溶劑和固相萃取等；樣品中廣譜的清潔劑，離子交換層析可有效地去除非離子和兩性清潔劑；類似于鹽類，脂質(zhì)廣泛存在于生物的體液中。許多蛋白質(zhì)會(huì)結(jié)合脂質(zhì)，從而降低溶解性，甚至影響等電點(diǎn)和分子量。丙酮沉淀或結(jié)合 TCA/丙酮可以有效去除脂質(zhì)；多聚糖和核酸可能和兩性電解質(zhì)反應(yīng)，造成雙向電泳膠上紋理的出現(xiàn)、使膠的背景產(chǎn)生拖尾和堵塞聚丙烯酰胺膠上的小孔。用 TCA、丙酮 苯或酚/醋酸銨沉淀后離心從樣品中除去多聚糖是還是很有效的。